第一單元 基因工程
【重難點突破】
一、如何理解基因工程的概念和原理
1、操作環(huán)境是生物體外，典型過程是基因表達載體的構(gòu)建。
2、基因工程的優(yōu)點
（1）克服了遠緣雜交不親和的障礙�；蚬こ毯椭参矬w細胞雜交一樣，突破了有性生殖的局限。
（2）定向改造了生物性狀。與誘變育種相比較克服了誘變育種的突變的不定向性。
3、原理是基因重組。
4、操作層次：是分子水平。是獲取某生物的DNA分子片段，把它與另一個DNA分子片段結(jié)合成一個DNA分子。
5、實質(zhì)：A種生物的某個基因通過一定方式導(dǎo)入B種生物體內(nèi)并能進行基因表達�；驔]有改變，蛋白質(zhì)沒有改變，只是轉(zhuǎn)錄和翻譯吃場所發(fā)生改變。
6、目的基因和載體能夠形成重組DNA分子的基礎(chǔ)是
（1）物質(zhì)組成相同，都是四種脫氧核苷酸組成。
（2）空間結(jié)構(gòu)相同，都是規(guī)則的雙螺旋結(jié)構(gòu)。
（3）結(jié)構(gòu)和功能單位相同，基因是控制生物性狀的結(jié)構(gòu)和功能單位。性狀都是蛋白質(zhì)表現(xiàn)的。
（4）遵循的基因表達原則相同，基因表達包括了基因的復(fù)制，轉(zhuǎn)錄和翻譯，都遵循中心法則。
（5）遺傳密碼相同，所有生物共用一套遺傳密碼。
【典題演示】
1、（2011溫州十校）采用基因工程技術(shù)將人凝血因子基因?qū)肷窖蚴芫�，培育出了轉(zhuǎn)基因羊。但是，人凝血因子只存在于該轉(zhuǎn)基因羊的乳汁中。以下有關(guān)敘述，正確的是（ ）
A．如果人凝血因子基因的核苷酸序列已知，可用人工合成的方法獲得該目的基因
B．人體細胞中凝血因子基因進入羊受精卵細胞后，其傳遞和表達不再遵循中心法則
C．在該轉(zhuǎn)基因羊體內(nèi)，人凝血因子基因存在于乳腺細胞，而不存在于其他體細胞中
D．人凝血因子基因開始轉(zhuǎn)錄后，DNA聚合酶以DNA分子的一條鏈為模板合成mRNA
【答案】A
【解析】掌握基因工程的原理是突破口。當(dāng)已知某種基因的核苷酸序列，可以進行人工合成；目的基因的表達仍然遵循中心法則；由于目的基因是導(dǎo)入受精卵，所有體細胞都含有目的基因，只有在乳腺細胞中表達，是因為目的基因連接了乳蛋白的基因的啟動子；轉(zhuǎn)錄需要的酶是RNA聚合酶。
【變式訓(xùn)練1】
1、（2010臨沂一模）轉(zhuǎn)基因植物是通過基因工程擁有其他物種基因即外源基因的植物。下列有關(guān)敘述中，正確的是（ ）
A．外源基因就是目的基因
B．外源基因的遺傳都遵循孟德爾遺傳定律
C．基因工程中的運載體質(zhì)粒是細胞核內(nèi)能夠復(fù)制的DNA分子
D．通過基因工程，植物細胞也能合成某些細菌的蛋白質(zhì)
【答案】D
【解析】掌握目的基因和外源基因的關(guān)系是突破口。把插入到載體內(nèi)的那個特定的片段基因稱為外源基因，而將那些已被或者準(zhǔn)備要被分離，表達的特定基因稱為目的基因。外源基因針對受體生物而言是受體生物不具有的基因，目的基因是針對人的需要而言。外源基因如果存在線粒體、葉綠體、質(zhì)�；蛘咴思毎腄NA上是不遵循孟德爾的遺傳規(guī)律的；質(zhì)粒是存在細胞質(zhì)的環(huán)狀DNA；棉花的抗蟲基因的表達證明植物細胞也能合成某些細菌的蛋白質(zhì)。
【變式訓(xùn)練2】、（2010蘇北四市三模）下列過程一定能夠?qū)е翫NA分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變的是
A．基因工程 B．DNA分子擴增 C．染色體變異 D．交叉互換
【答案】A
【解析】正確掌握影響DNA分子結(jié)構(gòu)的因素和方式是突破口。DNA分子擴增是以DNA分子作為單位，進行半保留復(fù)制增加DNA分子數(shù)目；染色體的變異和交叉互換是發(fā)生在基因數(shù)量或者位置的改變，并沒有影響DNA分子內(nèi)部；只有基因工程是在一個DNA分子內(nèi)部插入了另外一個DNA分子的片段。
【變式訓(xùn)練3】、（2010蘇州中學(xué)）（多選）下列關(guān)于基因工程的敘述，正確的是
A.目的基因和受體細胞均可來自動物、植物或微生物
B.限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶是兩類常用的工具酶
C.人胰島素原基因在大腸桿菌中表達的胰島素原有生物活性
D.載體上的抗性基因有利于篩選含重組DNA的細胞和促進目的基因的表達
【答案】AB
二、基因工程操作常用的工具有哪些？
1、限制酶又稱限制性核酸內(nèi)切酶
（1）化學(xué)本質(zhì) ：蛋白質(zhì)
（2）來源：主要來源于原核生物，是原核生物切斷入侵細胞內(nèi)外源DNA的保護自身的工具。
（3）作用：具有酶的共性催化作用外還用于對DNA分子的切割獲取目的基因和對載體的切割。
（4）特異性，能夠識別特定的脫氧核苷酸序列，并有特定的切割位點。切割的化學(xué)鍵叫磷酸二酯鍵。
切割目的基因和載體時要用同一中限制酶。
（5）切割的結(jié)果有兩種分別是粘性末端和平末端。
2、DNA連接酶
（1）種類：E.coliDNA連接酶和T4DNA連接酶。
（2）作用：是連接兩個DNA片段形成磷酸二酯鍵。
（3）適用對象：E.coliDNA連接酶是連接粘性末端，T4DNA連接酶是連接粘性末端和平末端。
（4）與DNA聚合酶的比較：相同點都可以形成磷酸二酯鍵；不同點是DNA連接酶是連接DNA片段形成重組DNA分子，DNA聚合酶是把游離的脫氧核苷酸按照堿基互補配對原則，連接在一條脫氧核苷酸鏈上形成新的DNA分子。
3、載體
（1）常用載體是質(zhì)粒，本質(zhì)是小型環(huán)狀DNA；其他載體有λ噬菌體的衍生物、動植物病毒等。
（2）功能：將目的基因?qū)胧荏w細胞。
（3）載體必需具備的條件：能夠在宿主細胞內(nèi)穩(wěn)定保存并大量復(fù)制；有一個至多個限制酶的切割位點，以便于與外源基因進行連接；有特殊的遺傳標(biāo)記基因，供重組DNA的檢測和鑒定。
（4）特別注意：①現(xiàn)在使用的載體多是人工改造的；②常見的標(biāo)記基因有抗生素抗性基因、發(fā)光基因和產(chǎn)生特點顏色的表達產(chǎn)物基因等；③質(zhì)粒可以在自身細胞、受體細胞或者體外環(huán)境都可以進行自我復(fù)制；④載體上最好是每種酶的切點只有一個；⑤細胞膜上的載體是蛋白質(zhì)，具有運輸作用。
【典題演示2】
1、 (2010無錫高三)基因工程中，需使用特定的限制酶切割目的基因和質(zhì)粒，便于重組和篩選。已知限制酶I的識別序列和切點是?C↓GATCC?限制酶Ⅱ的識別序列和切點是?↓GATC?。根據(jù)圖示判斷下列操作正確的是（ ）
A.目的基因和質(zhì)粒均用限制酶Ⅱ切割
B.目的基因和質(zhì)粒用限制酶I切割
C.質(zhì)粒用限制酶Ⅱ切割，目的基因用限制酶I切割
D.質(zhì)粒用限制酶I切割，甘的基因用限制酶Ⅱ切割
【變式訓(xùn)練4】
1、下列有關(guān)DNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的說法正確的是（ ）
A．需要引物 B．始終在高于70℃的條件下進行
C．需要加DNA連接酶 D．需要加熱穩(wěn)定DNA聚合酶
【變式訓(xùn)練5】、已知某種限制性內(nèi)切酶在一線性DNA分子上有3個酶切位點，如圖中箭頭所指，如果該線性DNA分子在3個酶切位點上都被該酶切斷，則會產(chǎn)生a、b、c、d四種不同長度的DNA片段�，F(xiàn)在多個上述線性DNA分子，若在每個DNA分子上至少有1個酶切位點被該酶切斷，則從理論上講，經(jīng)該酶切后，這些線性DNA分子最多能產(chǎn)生長度不同的DNA片段種類數(shù)是
A.3 B.4 C.9 D.12
【變式訓(xùn)練6】、2008年諾貝爾化學(xué)獎授予了“發(fā)現(xiàn)和發(fā)展了水母綠色熒光蛋白“的三位科學(xué)家。將綠色熒光蛋白基因的片段與目的基因連接起來組成一個融合基因，再將該融合基因轉(zhuǎn)入真核生物細胞內(nèi)，表達出的蛋白質(zhì)就會帶有綠色熒光。綠色熒光蛋白在該研究中的主要作用是
A．追蹤目的基因在細胞內(nèi)的復(fù)制過程
B．追蹤目的基因插入到染色體上的位置
C．追蹤目的基因編碼的蛋白質(zhì)在細胞內(nèi)的分布
D．追蹤目的基因編碼的蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)
三 基因工程的操作程序有哪些？
1、目的基因的獲取
技術(shù)：限制酶切割?切割出粘性末端和平末端。
（1）從基因文庫中獲取目的基因；
文庫類型cDNA文庫基因組文庫
文庫大小小大
基因中的啟動子無有
基因的多少某種生物的部分基因某種生物的全部基因
物種之間的基因交流可以部分基因可以
說明基因文庫的組建過程包含了基因工程的操作過程。從基因文庫獲取目的基因的優(yōu)點是操作簡便；缺點是工作量大，具有一定的盲目性。
（2）利用PCR技術(shù)擴增目的基因；
PCR技術(shù)DNA復(fù)制
相
同
點原理DNA復(fù)制（堿基互補配對原則）
原料四種游離脫氧核苷酸
條件模板、ATP、酶、原料、引物
不
同
點解旋方式DNA在高溫下解旋解旋酶催化
場所體外復(fù)制主要在細胞核內(nèi)
酶Taq酶細胞內(nèi)的DNA聚合酶
結(jié)果短時間內(nèi)形成大量的DNA片段形成整個DNA分子
（3）人工合成。常見的有反轉(zhuǎn)錄法和氨基酸序列合成法兩種。
①反轉(zhuǎn)錄法 是在核糖體合成多肽的旺盛時期，首先把含有目的基因的mRNA的多聚核糖體提取出來，分離出mRNA，然后以mRNA為模板，用反轉(zhuǎn)錄酶合成一個互補的DNA，即cDNA單鏈，再以此單鏈為模板合成出互補鏈，就成為雙鏈DNA分子。這種方法專一性強，但是操作過程比較麻煩，特別是mRNA很不穩(wěn)定、生存時間短，所以要求的技術(shù)條件較高。
②氨基酸序列合成法是建立在DNA序列分析基礎(chǔ)上的。當(dāng)把一個基因的核苷酸序列搞清楚后，可以按圖紙先合成一個個含少量（10～15個）核苷酸的DNA片段，再利用堿基對互補的關(guān)系使它們形成雙鏈片段，然后用連接酶把雙鏈片段逐個按順序連接起來，使雙鏈逐漸加長，最后得到一個完整的基因。這種方法專一性最強，現(xiàn)在用計算機自動控制的DNA合成儀，進行基因合成，使基因合成的效率大大提高。但是這種方法目前僅限于合成核苷酸對較少的一些簡單基因，而且必須事先把它們的核苷酸序列搞清楚。對于許多復(fù)雜的、目前尚不知道核苷酸序列的基因就不能用這種方法合成，只能用前兩種方法或其他方法分離或合成。這種合成基因的方法還有一個很大的優(yōu)點，就是可以人工合成自然界不存在的新基因，使生物產(chǎn)生新的性狀以滿足人類需求。因此，這一方法今后將隨著技術(shù)的不斷改進而得到越來越廣泛的應(yīng)用。
2、基因表達載體的構(gòu)建是基因工程的核心步驟。
（1）基因表達載體的結(jié)構(gòu)組成：
啟動子是啟動轉(zhuǎn)錄的DNA片段；終止子是終止轉(zhuǎn)錄的DNA片段；目的基因；抗生素抗性基因是標(biāo)記基因；復(fù)制原點DNA的復(fù)制有特定的起始位點。
（2）技術(shù)：應(yīng)用DNA連接酶連接末端。
3、將目的基因?qū)胧荏w細胞
（1）導(dǎo)入雙子葉植物一般用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法；農(nóng)桿菌是普遍存在于土壤中的一種革蘭氏陰性細菌，它能在自然條件下趨化性地感染大多數(shù)雙子葉植物的受傷部位(受傷處的細胞會分泌大量酚類化合物,從而使農(nóng)桿菌移向這些細胞)，并誘導(dǎo)產(chǎn)生冠癭瘤或發(fā)狀根。
根癌農(nóng)桿菌和發(fā)根農(nóng)桿菌中細胞中分別含有Ti質(zhì)粒和Ri質(zhì)粒，其上有一段T-DNA，農(nóng)桿菌通過侵染植物傷口進入細胞后，可將T-DNA插入到植物基因組中,并且可以通過減數(shù)分裂穩(wěn)定的遺傳給后代，這一特性成為農(nóng)桿菌介導(dǎo)法植物轉(zhuǎn)基因的理論基礎(chǔ)。
我們將目的基因插入到經(jīng)過改造的T-DNA區(qū)，借助農(nóng)桿菌的感染實現(xiàn)外源基因向植物細胞的轉(zhuǎn)移與整合，然后通過細胞和組織培養(yǎng)技術(shù)，再生出轉(zhuǎn)基因植株。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法起初只被用于雙子葉植物中，近年來，農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化在一些單子葉植物（尤其是水稻）中也得到了廣泛應(yīng)用。
（2）棉花用花粉管通道法；亦稱受粉后外源基因?qū)胫参锏募夹g(shù)，是利用植物受粉后所形成的天然花粉管通道（花粉引導(dǎo)組織），經(jīng)珠心通道將外源DNA攜帶進入胚囊，轉(zhuǎn)化受精卵或其前后的生殖細胞（精子、卵子），由于它們?nèi)蕴幱谖葱纬杉毎诘念愃?原生質(zhì)體"狀態(tài)，并且正在進行活躍的DNA復(fù)制、分離和重組，所以很容易將外源DNA片段整合進受體基因組中，以達遺傳轉(zhuǎn)化的目的。
在雙受精過程完成后，受精卵細胞的初次分裂需要充分的物質(zhì)和能量積累。此時期的細胞尚不具備完整垢細胞壁和核膜系統(tǒng)，細胞內(nèi)外的物質(zhì)交流頻繁。通過花粉管通道途徑滲透進入胚囊的轉(zhuǎn)基因片段就有可能被吸入受精卵細胞，并進一步地通過尚不明確的機理被整合進入受體基因組中。
（3）單子葉植物基因槍法；
（4）導(dǎo)入動物細胞用顯微注射法；在顯微鏡下，用一根極細的玻璃針(直徑1～2微米)直接將DNA注射到胚胎的細胞核內(nèi)，再把注射過DNA的胚胎移植到動物體內(nèi)，使之發(fā)育成正常的幼仔，使用這種方法進行外源基因整合成功率約為10％。
（5）導(dǎo)入微生物細胞，用Ca2+處理成為感受態(tài)細胞。在CaCl2溶液中，細菌細胞會發(fā)生膨脹，同時Ca2+會使細胞膜磷脂雙分子層形成液晶結(jié)構(gòu)，促使細胞外膜與內(nèi)膜間隙中的部分核酸酶解離開來，離開所在區(qū)域，誘導(dǎo)細胞成為感受態(tài)細胞
同時Ca2+能與加入的DNA分子結(jié)合，形成抗脫氧核糖核酸酶的羥基－磷酸鈣復(fù)合物，并粘附在細菌細胞膜的外表面上。當(dāng)42度熱刺激短暫處理細菌細胞時，細胞膜的液晶結(jié)構(gòu)會發(fā)生劇烈擾動，并隨機出現(xiàn)許多間隙，為DNA分子提供進入細胞的通道。
總的來說就是細胞在低溫Ca2+等因子誘導(dǎo)下,細胞膜通透性發(fā)生改變,膜通透性的改變使細胞可以攝取DNA。
（2）特點：四個步驟中唯一不涉及堿基互補配對的。選用微生物作為受體細胞的理由是個體微小，代謝旺盛，繁殖速度快，獲得的目的基因產(chǎn)物多。
4、目的基因的檢測和鑒定
（1）分子水平的檢測：利用DNA分子雜交法檢測目的基因及其產(chǎn)物mRN；用抗原?抗體雜交檢驗?zāi)康幕虻牡鞍踪|(zhì)產(chǎn)物；檢測結(jié)果看是否出現(xiàn)雜交帶。
（2）個體水平檢測。
【典題演示3】
1、（2010浙江）在用基因工程技術(shù)構(gòu)建抗除草劑的轉(zhuǎn)基因煙草過程中，下列操作錯誤的是（ ）
A.用限制性核酸內(nèi)切酶切割煙草茶葉病毒的核酸
B.用DNA連接酶連接經(jīng)切割的抗除草劑基因和載體
C.將重組DNA分子導(dǎo)入原生質(zhì)體
D.用含除草劑的培養(yǎng)基篩選轉(zhuǎn)基因煙草細胞
【答案】A
【解析】本題考查基因工程的有關(guān)知識，基因工程的一般過程：①用限制性核酸內(nèi)切酶切割含目的基因的DNA分子（除草劑基因）和運載體（質(zhì)粒），②用DNA連接酶連接切割好的目的基因和運載體③重組DNA分子導(dǎo)入受體細胞，因為是植物可以說是原生質(zhì)體④用相應(yīng)的試劑和病原體帥選轉(zhuǎn)基因細胞⑤用植物組織培養(yǎng)技術(shù)抗除草劑的轉(zhuǎn)基因煙草（表達）。
【變式訓(xùn)練7】
1、（2010江蘇）下列關(guān)于轉(zhuǎn)基因植物的敘述。正確的是
A．轉(zhuǎn)入到油菜的抗除草劑基因，可能通過花粉傳人環(huán)境中
B．轉(zhuǎn)抗蟲基因的植物．不會導(dǎo)致昆蟲群體抗性基因擷宰增加
C．動物的生長激素基因轉(zhuǎn)人植物后不能表達
D．如轉(zhuǎn)基因植物的外源基因來源于自然界，則不存在安全性問題
【答案】A
【解析】本題考查了轉(zhuǎn)基因技術(shù)的安全性問題。轉(zhuǎn)入到油菜的基因，可以通過花粉傳入環(huán)境中；由于植物與害蟲間是相互選擇的，轉(zhuǎn)抗蟲基因植物可使昆蟲群體抗性基因頻率增加；動物生長素基因轉(zhuǎn)入植物后也能表達；轉(zhuǎn)基因技術(shù)的安全性問題，要通過驗證才能得到證實。
【變式訓(xùn)練8】、（2009上海理綜）科學(xué)家運用基因工程技術(shù)將人胰島素基因與大腸桿菌的質(zhì)粒DNA分子重組，并且在大腸桿菌體內(nèi)獲得成功表達。圖示a處為胰島素基因與大腸桿菌質(zhì)粒DNA結(jié)合的位置，它們彼此能結(jié)合的依據(jù)是
A．基因自由組合定律 B．半保留復(fù)制原則
C．基因分離定律 D．堿基互補配對原則
【答案】D
【解析】本題考查基因工程的相關(guān)知識，重組質(zhì)粒依據(jù)的是粘性末端的堿基互補配對原則。
【變式訓(xùn)練9】、（2009廣東理基）錢永健先生因在研究綠色熒光蛋白方面的杰出成就而獲2008年諾貝爾獎。在某種生物中檢測不到綠色熒光，將水母綠色熒光蛋白基因轉(zhuǎn)入該生物體內(nèi)后，結(jié)果可以檢測到綠色熒光。由此可知
A．該生物的基因型是雜合的
B．該生物與水母有很近的親緣關(guān)系
C．綠色熒光蛋白基因在該生物體內(nèi)得到了表達
D．改變綠色熒光蛋白基因的1個核苷酸對，就不能檢測到綠色熒光
【答案】C
【解析】某種生物中檢測不到綠色熒光，將水母綠色熒光蛋白基因轉(zhuǎn)入該生物體內(nèi)后，結(jié)果可以檢測到綠色熒光，說明綠色熒光蛋白基因在該生物體內(nèi)得到了表達。
四、基因工程和蛋白質(zhì)工程有哪些實際應(yīng)用？
1、轉(zhuǎn)基因植物：
（1）抗蟲轉(zhuǎn)基因植物：用于殺蟲的基因主要是Bt毒蛋白基因、蛋白酶抑制劑基因、淀粉酶抑制劑基因、植物凝集素基因。
（2）抗病轉(zhuǎn)基因植物：抗病毒植物使用最多的病毒外殼蛋白基因和病毒復(fù)制酶基因；抗真菌轉(zhuǎn)基因使用幾丁質(zhì)酶基因和抗毒素合成基因。
（3）其他抗逆轉(zhuǎn)基因植物 導(dǎo)入調(diào)節(jié)滲透壓的基因；魚的抗凍蛋白基因；抗除草劑基因。
2、轉(zhuǎn)基因動物
（1）導(dǎo)入外源生長素基因可以提高動物生長速度
（2）導(dǎo)入腸乳糖酶基因，改善奶牛的牛奶品質(zhì)
（3）導(dǎo)入血清白蛋白等基因可以用轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)藥物
（4）用轉(zhuǎn)基因動物作器官移植的供體
3、蛋白質(zhì)工程
【典題演示4】
（2010全國2）下列敘述符合基因工程概念的是
A．B淋巴細胞與腫瘤細胞融合，雜交瘤細胞中含有B淋巴細胞中的抗體基因
B．將人的干擾素基因重組到質(zhì)粒后導(dǎo)入大腸桿菌，獲得能產(chǎn)生人干擾素的菌株
C．用紫外線照射青霉菌，使其DNA發(fā)生改變，通過篩選獲得青霉素高產(chǎn)菌株
D．自然界中天然存在的噬菌體自行感染細菌后其DNA整合到細菌DNA上
【答案】B
【解析】 B淋巴細胞與腫瘤細胞融合，雜交瘤細胞中含有B淋巴細胞中的抗體基因?qū)儆趧游锛毎こ痰膬?nèi)容；用紫外線照射青霉菌，使其DNA發(fā)生改變，通過篩選獲得青霉素高產(chǎn)菌株
屬于微生物的發(fā)酵工程的內(nèi)容；自然狀態(tài)下，一般不能自行形成重組DNA分子。
【總結(jié)提升】
兩種工具酶，三種工具，四步操作。
本文來自：逍遙右腦記憶 http://yy-art.cn/gaosan/78519.html
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