DNA重組技術(shù)的基本工具：

1、基因工程的概念：

基因工程的別名	基因拼接技術(shù)或DNA重組技術(shù)
操作環(huán)境	生物體外
操作對(duì)象	基因
操作水平	DNA分子水平
基本過程	剪切→拼接→導(dǎo)入→表達(dá)
結(jié)果	人類需要的基因產(chǎn)物

2、基本工具：
（1）“分子手術(shù)刀”——限制性核酸內(nèi)切酶（限制酶）
①來源：主要是從原核生物中分離純化出來的。
②功能：能夠識(shí)別雙鏈DNA分子的某種特定的核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開，因此具有專一性。
③結(jié)果：經(jīng)限制酶切割產(chǎn)生的DNA片段末端通常有兩種形式：黏性末端和平末端。
即當(dāng)限制性內(nèi)切酶作用于特定的DNA時(shí)，把這段序列沿著特定的切點(diǎn)切開的這個(gè)過程分兩種情況：
a、沿著中軸線切口（即沿著DNA雙鏈中對(duì)應(yīng)的磷酸二酯鍵）切開，得到的就是兩個(gè)平末端；
b、在中軸線的兩端切口切開，得到的就是兩個(gè)黏性末端。例如：EcoRⅠ限制性內(nèi)切酶就可以識(shí)別G/AATTC的DNA序列，然后在G和A間切開，得到的就是兩個(gè)黏性末端（之間可以根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則重組）限制酶的切口不都是一長(zhǎng)一短的，一長(zhǎng)一短的叫黏性末端，一樣長(zhǎng)的叫平末端�！罢承阅┒恕痹诟咧薪滩闹幸沧鳌梆ば阅┒恕�。如圖：


（2）“分子縫合針”——DNA連接酶

種類	E·coli-DNA連接酶	T4-DNA連接酶
來源	大腸桿菌	T4噬菌體
功能特性	只能將雙鏈DNA片段互補(bǔ)的黏性末端之間的磷酸二酯鍵連接起來	縫合兩種末端，但連接平末端之間的效率較低
相同點(diǎn)	都縫合磷酸二酯鍵，如圖：

（3）“分子運(yùn)輸車”——載體
①載體具備的條件：能在受體細(xì)胞中復(fù)制并穩(wěn)定保存；具有一至多個(gè)限制酶切點(diǎn)，供外源DNA片段插入；具有標(biāo)記基因，供重組DNA的鑒定和選擇。
②最常用的載體是質(zhì)粒，它是一種裸露的、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的、獨(dú)立于細(xì)菌染色體之外，并具有自我復(fù)制能力的雙鏈環(huán)狀DNA分子。
③其它載體：噬菌體的衍生物、動(dòng)植物病毒

知識(shí)點(diǎn)撥：

1、限制酶識(shí)別的序列的特點(diǎn)：呈現(xiàn)堿基互補(bǔ)對(duì)稱，無論是奇數(shù)個(gè)堿基還是偶數(shù)個(gè)堿基，都可以找到一條中心軸線，如圖，中軸線兩側(cè)的雙鏈DNA上的堿基是反向?qū)ΨQ重復(fù)排列的。如以中心線為軸，兩側(cè)堿基互補(bǔ)對(duì)稱；以為軸，兩側(cè)堿基互補(bǔ)對(duì)稱。

2、獲取目的基因和切割載體時(shí)使用同種限制酶，目的是產(chǎn)生相同的黏性末端。
3、獲取一個(gè)目的基因需限制酶剪切兩次，共產(chǎn)生 4個(gè)黏性末端或平末端。
4、限制酶切割位點(diǎn)的選擇必須保證標(biāo)記基因的完整性，以便于檢測(cè)。

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