一場(chǎng)“風(fēng)暴”幾乎席卷了整個(gè)生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域，而這場(chǎng)“風(fēng)暴”的中心就是CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)。4月，美國(guó)批準(zhǔn)了首個(gè)CRISPR/Cas9技術(shù)的專利申請(qǐng)。11月，美國(guó)加州大學(xué)伯克利分校的杜德納(Doudna)和德國(guó)亥姆霍茲傳染研究中心的卡彭特(Charpentier)因在CRISPR研究方面做出了突出的貢獻(xiàn)而獲得了今年的科學(xué)突破獎(jiǎng)。CRISPR/Cas9技術(shù)究竟是什么?它有著什么樣的“魔力”能夠讓世界范圍內(nèi)生命科學(xué)領(lǐng)域的專家學(xué)者們對(duì)它鐘愛有加?讓我們一起來揭開它神秘的面紗。起源和發(fā)展

1987年，日本學(xué)者發(fā)現(xiàn)，在大腸桿菌的基因末端(堿性磷酸酶基因的3’側(cè)翼區(qū))有一段間隔重復(fù)的DNA序列。之后更多的研究證實(shí)，這種重復(fù)序列廣泛存在于細(xì)菌中。2002年，將其命名為CRISPR(clustered regularly inter spaced short palindromic repeats)，即成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列區(qū)域(圖1)。

2005年，美國(guó)等國(guó)家進(jìn)行的多項(xiàng)研究顯示，CRISPR中的間隔序列和噬菌體或質(zhì)粒的序列之間存在同源性，有些甚至達(dá)100%。這表明這些間隔序列可能來源于噬菌體基因組。2007年，科學(xué)家通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)了該觀點(diǎn)，并在鏈球菌中(圖2)通過增減CRISPR中的序列改變了其對(duì)噬菌體的免疫力。

在CRISPR序列位點(diǎn)的周圍存在著一組序列(Cas蛋白組)，這其中包含有核酸內(nèi)切酶、核酸外切酶和DNA-結(jié)合區(qū)等結(jié)構(gòu)域。隨著對(duì)不同細(xì)菌的基因組的測(cè)序和更多相關(guān)研究的積累，越來越多不同細(xì)菌中的CRISPR系統(tǒng)和Cas基因被發(fā)現(xiàn)，其作用機(jī)理也逐漸清晰。而Cas蛋白就是其中位點(diǎn)的關(guān)鍵作用點(diǎn)，研究者們根據(jù)其作用方法的不同，將其分為了三類(Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型)。

CRISPR/Cas9技術(shù)開始嶄露頭角，源于杜德納(Doudna)和其同事發(fā)現(xiàn)了一個(gè)比較簡(jiǎn)單的CRISPR(Ⅱ型)系統(tǒng)并對(duì)其進(jìn)行了改造。在這套系統(tǒng)中，只需要一個(gè)Cas9核酸內(nèi)切酶和一條合成兩種RNA(CRISPR-derived RNA,crRNA和trans-acti vating RNA，tracrRNA)的嵌合RNA，就可以對(duì)雙鏈DNA進(jìn)行編輯(圖3)。同時(shí)，他們還闡明了其中RNA和編輯目標(biāo)DNA之間堿基配對(duì)的原則。1月，科學(xué)家用這項(xiàng)技術(shù)首次成功對(duì)人類細(xì)胞的特定基因進(jìn)行了定向編輯。

用途及前景

CRISPR/Cas9何以能夠“引無數(shù)英雄競(jìng)折腰”?通過檢索近兩年該技術(shù)所取得的成果，也許從中可略知一二。

構(gòu)建動(dòng)物疾病模型通過該技術(shù)目前已經(jīng)成功構(gòu)建了攜帶定向突變的基因工程猴模型(圖4)、人肝癌小鼠模型、條件性表達(dá)Kras肺癌基因小鼠模型等，這些模型可以用于疾病機(jī)制及藥效的研究。

基因治療和預(yù)防通過該技術(shù)現(xiàn)已成功地將艾滋病病毒從培養(yǎng)的人類細(xì)胞中清除。我國(guó)學(xué)者也已利用這項(xiàng)技術(shù)將修復(fù)后的Crygc基因(小鼠遺傳性白內(nèi)障基因)傳遞給下一代，實(shí)現(xiàn)了治愈小鼠遺傳性白內(nèi)障的目的。因此，未來或許只需要進(jìn)行基因的修飾就可以根治和預(yù)防某些疾病。

生物物種的改良我國(guó)學(xué)者已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了水稻特定基因的高效、可穩(wěn)定遺傳，對(duì)現(xiàn)有的基因進(jìn)行替換、刪除或敲入，促進(jìn)物種的改良。這可以大大加快良種的育種速度。

解密人類基因功能基因的定點(diǎn)敲除可以對(duì)單個(gè)基因的特定生物學(xué)功能開展研究，揭示其作用，為完成人類基因組功能圖譜的繪制提供可能。

組織和器官再生與誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells，IPS細(xì)胞)技術(shù)等相結(jié)合，使修復(fù)后的IPS細(xì)胞(見備注)重新發(fā)育成正常的組織和器官，供患者移植。優(yōu)點(diǎn)和仍面臨的問題

CRISPR/Cas9技術(shù)較之前的基因編輯技術(shù)，如歸巢內(nèi)切酶(HEase)、鋅指核酸酶(ZFN)和轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶(TALEN)技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)有哪些呢?

首先，CRISPR/Cas9技術(shù)的可編輯位置較多，理論上每8個(gè)堿基中就可以找到一個(gè)可進(jìn)行編輯的位置。

其次，CRISPR/Cas9技術(shù)更具拓展性，如其可僅對(duì)DNA雙鏈中的單鏈進(jìn)行編輯，規(guī)避染色體變異的風(fēng)險(xiǎn)。

再次，Cas9蛋白可以與其他功能蛋白連接，在特定DNA序列上進(jìn)行相關(guān)蛋白作用的研究。

最后，也是最重要的一點(diǎn)，CRISPR/Cas9技術(shù)操作簡(jiǎn)便且相對(duì)之前的編輯技術(shù)經(jīng)濟(jì)得多，只須簡(jiǎn)單的幾步就可完成，幾乎所有實(shí)驗(yàn)室都可以進(jìn)行。

脫靶效應(yīng)(off-target effect)是目前CRISPR/Cas9面臨的最大問題，即在基因組的非目標(biāo)位置產(chǎn)生非必要的DNA突變。通俗來講就是辨識(shí)錯(cuò)了需要編輯的目標(biāo)基因。對(duì)于這個(gè)問題，我們咨詢了北京生命科學(xué)研究所的張昱博士，他認(rèn)為，目前對(duì)于CRISPR/Cas9編輯過程中的脫靶效應(yīng)，可以行全基因組測(cè)序等方法對(duì)其檢測(cè)，通過控制反應(yīng)的時(shí)間和空間可以降低其效應(yīng)。總體來說，并沒有發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas9有嚴(yán)重和預(yù)料之外的脫靶效應(yīng)。

結(jié)語(yǔ)

上世紀(jì)70年代末，科學(xué)家就已經(jīng)能夠通過將人源基因編輯到大腸桿菌基因中進(jìn)行胰島素的生產(chǎn),這表明基因編輯技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有著巨大的應(yīng)用潛力。然而，早在2000年，人類基因組的草圖就已經(jīng)基本繪制完成，但十幾年來，揭示這些基因的具體功能和作用的研究并沒有取得突破性的進(jìn)展。其中一個(gè)重要的原因就在于，以往進(jìn)行基因編輯的技術(shù)操作過程復(fù)雜、耗費(fèi)昂貴等。而現(xiàn)在，這一切都因CRISPR/Cas9技術(shù)的出現(xiàn)而發(fā)生著巨大的改變。

在科幻電影中，我們常常可以看到類似的場(chǎng)景，當(dāng)人患病時(shí)，只須躺在治療床上，機(jī)器就會(huì)對(duì)人類的基因進(jìn)行掃描、定位并治愈疾病，這或許在不久的將來即可成為現(xiàn)實(shí)。正如美國(guó)哈佛大學(xué)干細(xì)胞與再生生物學(xué)系生物學(xué)家、諾貝爾獎(jiǎng)獲得者克雷格?梅洛(Craig Mello)所說：“正是因?yàn)橛辛薈RISPR，使得過去一切不可能的想法變成了可能。我們的生物機(jī)體究竟是如何工作的，仍然是一個(gè)謎，我們僅僅是剛剛邁入了研究這個(gè)生命領(lǐng)域的邊緣”。

注：IPS細(xì)胞是將人體皮膚細(xì)胞等體細(xì)胞通過基因轉(zhuǎn)染等技術(shù)直接重構(gòu)成為胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell，ESC)樣具有多分化潛能的細(xì)胞。

本文來自：逍遙右腦記憶 http://www.yy-art.cn/gaozhong/751124.html

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