新的基因組編輯工具??如ZFNs、TALENs以及最近的CRISPR/Cas9系統(tǒng)，已經(jīng)大大提高了在不同動(dòng)物模型中敲除基因的能力，包括斑馬魚。然而，對(duì)數(shù)量龐大的動(dòng)物進(jìn)行篩選，所需的時(shí)間和成本，仍然是一個(gè)瓶頸。

最近，意大利多恩動(dòng)物研究所（StazionezoologicaAntonDohrn）的研究人員，提出了一種快速的、便宜的CRISPR/Cas9斑馬魚突變體篩選方法，有潛力應(yīng)用于斑馬魚以及適合于基因組編輯的每種動(dòng)物模型的高通量篩選。相關(guān)研究結(jié)果發(fā)表在12月16日的《MolecularBiotechnology》。延伸閱讀：劉小樂(lè)教授：CRISPR高通量篩選的新算法。

在各個(gè)研究領(lǐng)域中，基因組操縱越來(lái)越正成為反向遺傳學(xué)研究的一種常見方法。特別是，隨著新編輯工具（如ZENs、TALENs以及最近的CRISPR/Cas9系統(tǒng)）的引入，已經(jīng)徹底改變了基因組工程研究。

然而，隨著產(chǎn)生變異動(dòng)物的能力增加，突變體的篩選成為了一個(gè)瓶頸。到目前為止，許多不同的技術(shù)，如直接測(cè)序、熒光定量PCR、T7核酸內(nèi)切酶I測(cè)定、PAGE和HRM，已被描述為檢測(cè)目標(biāo)位點(diǎn)中InDel的有效方法，但同時(shí)并不是每個(gè)人都能使用它們。

當(dāng)然，最翔實(shí)的方法是通過(guò)Sanger色譜分析法進(jìn)行直接測(cè)序；然而，這種方法意味著幾個(gè)步驟，例如樣品剪碎、基因組DNA提取、靶區(qū)域的PCR擴(kuò)增、克隆和質(zhì)粒純化，這對(duì)于大規(guī)模篩選來(lái)說(shuō)成本太高了。

出于這個(gè)原因，PAGW和T7核酸內(nèi)切酶I分析，由于成本合適，正在成為最常用的方法，但是它們存在一定的局限性，例如耗時(shí)的步驟和假陽(yáng)性。在可靠性和運(yùn)行時(shí)間方面，一種有效的替代方法，以當(dāng)前用于大規(guī)模InDels檢測(cè)的、最有效的HRM技術(shù)為代表。事實(shí)上，一旦實(shí)驗(yàn)室有適當(dāng)?shù)脑O(shè)備，HRM程序是很簡(jiǎn)單和快速的；然而，并不是所有的實(shí)驗(yàn)室都配備有如此昂貴的設(shè)備。因此，目前迫切需要開發(fā)一種廉價(jià)而有效的策略，可以讓每個(gè)人都能用于高通量的突變體篩選。

在這項(xiàng)研究中，研究人員提出了一種新的分型方法，具有類似于HRM技術(shù)的有效率，但是成本更低，這種方法對(duì)用于qPCR的一種常見ViiATM7Real-TimePCR系統(tǒng)的一些參數(shù)進(jìn)行了修改。經(jīng)過(guò)幾次試驗(yàn)，研究人員優(yōu)化了反應(yīng)條件，重點(diǎn)是熔煉分析步驟。研究人員對(duì)熔煉分析參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，以獲得較高可能的檢測(cè)分辨率和重復(fù)性。

緩變率的增加，可使來(lái)自分析樣品類型的解離分析結(jié)果更加準(zhǔn)確，因?yàn)榉肿拥慕怆x動(dòng)力學(xué)更快。此外，研究人員優(yōu)化了工作流程，減少了反應(yīng)體積（總體積10ll）。這意味著，每個(gè)樣本只用5ll的FastSYBRGreenMaster混合液，從而大大降低了成本。

總而言之，這種方法提供了一種簡(jiǎn)單、快捷和低成本的InDels檢測(cè)程序，可以用于任何研究實(shí)驗(yàn)室。這種方法可以應(yīng)用于常規(guī)qPCR的ViiATM7Real-TimePCR系統(tǒng)，這樣就避開了昂貴實(shí)驗(yàn)室設(shè)備的必要性。與其他篩選方法相比，這種方法表現(xiàn)出更好的優(yōu)勢(shì)和劣勢(shì)比，可以被有利地用于常規(guī)篩查程序。此外，這種方法有潛力應(yīng)用于斑馬魚以及適合于基因組編輯的每種動(dòng)物模型的高通量篩選。

本文來(lái)自：逍遙右腦記憶 http://yy-art.cn/gaozhong/959687.html

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