輔導(dǎo)教案
導(dǎo)學(xué)誘思DAOXUEYOUSI

一、大腸桿菌
1．大腸桿菌屬于革蘭氏________性菌，為________型的腸道桿菌。
2．結(jié)構(gòu)：屬于________生物。
3．用途：是在________技術(shù)中被廣泛采用的工具。
4．與人類的關(guān)系：它生活在人類的________中，一般對人________(“有”還是“無”)害。有一些菌株對人體能產(chǎn)生危害，因?yàn)樗鼈兛梢郧治g________并產(chǎn)生________。任何大腸桿菌如果進(jìn)入人的________系統(tǒng)，都會對人體產(chǎn)生危害。
答案：1.陰　兼性厭氧
2．原核
3．基因工程
4．腸道　無　腸黏膜　毒素　泌尿
二、細(xì)菌的培養(yǎng)和分離
1．細(xì)菌的培養(yǎng)：
(1)細(xì)菌的繁殖：細(xì)菌以________的方式繁殖，分裂速度很快，約________分裂一次。
(2)培養(yǎng)細(xì)菌的方法：培養(yǎng)細(xì)菌，需要將________________________________________________________________________
轉(zhuǎn)移到________中，一般用________轉(zhuǎn)移帶菌的培養(yǎng)物。
(3)用不同培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)菌的差別：

接種后，培養(yǎng)細(xì)菌的培養(yǎng)基類型接種方法接種后培養(yǎng)的時(shí)間(單位：小時(shí))培養(yǎng)結(jié)果
液體培養(yǎng)基接種環(huán)直接接種培養(yǎng)8 h后每毫升培養(yǎng)基中有________個(gè)細(xì)菌
固體培養(yǎng)基用接種環(huán)在培養(yǎng)基上用________________________________________________________________________的方式接種(該法還可以用于______)培養(yǎng)10～20 h后一個(gè)細(xì)菌細(xì)胞會繁殖成許多個(gè)細(xì)菌細(xì)胞，這些細(xì)胞________________________________________________________________________________，形成____________________________________________________________
2.細(xì)菌的分離：
(1)分離的方法與特點(diǎn)：分離細(xì)菌有________和________2種。前者方法簡單，后者操作復(fù)雜，但是______________________________________________________________更易分開。
(2)本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行大腸桿菌分離，是用________法，就是在________培養(yǎng)基上進(jìn)行細(xì)菌的________。
答案：1.(1)分裂　20 min　(2)已有細(xì)菌的培養(yǎng)物　新的培養(yǎng)基　接種環(huán)　(3)幾億　劃線　分離細(xì)菌　緊緊聚集在一起
菌落
2.(1)劃線分離法　涂布分離法　單菌落　(2)劃線分離
固體平面　劃線培養(yǎng)

三、滅菌操作
1．滅菌操作的原因：為了獲得________的培養(yǎng)物，其關(guān)鍵是防止外________的入侵污染。因此，在培養(yǎng)微生物時(shí)必須進(jìn)行________操作。
2．無菌操作的條：
(1)首要條是________必須是無菌的；
(2)________必須是無菌的；
(3)________的過程必須是無菌的等。
答案：1.純凈　雜菌　無菌
2．(1)各種器皿　(2)各種培養(yǎng)基　(3)菌轉(zhuǎn)移操作
四、大腸桿菌的培養(yǎng)和分離實(shí)驗(yàn)
1．實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?br />(1)進(jìn)行大腸桿菌的________，利用________培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)的操作；
(2)進(jìn)行大腸桿菌的________，用________培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)菌的________培養(yǎng)；
(3)說明大腸桿菌培養(yǎng)的條和操作要求的原理。
2．實(shí)驗(yàn)步驟
(1)滅菌：用________在________壓力下對LB液體培養(yǎng)基、LB固體培養(yǎng)基和培養(yǎng)皿進(jìn)行滅菌________min。
(2)自________向________中轉(zhuǎn)移并分裝固體培養(yǎng)基：
待冷卻至______左右，將三角錐形瓶中的______培養(yǎng)基，在______上分裝至幾個(gè)______中，制成______培養(yǎng)基。
(3)將大腸桿菌自________轉(zhuǎn)移到________中的________培養(yǎng)基中培養(yǎng)：
將大腸桿菌用________在無菌操作下接種至三角錐形瓶中的________培養(yǎng)基中，在________搖床振蕩培養(yǎng)________，完成大腸桿菌的培養(yǎng)。
(4)將菌液在________培養(yǎng)基上進(jìn)行________分離：
從前一步培養(yǎng)得到的菌液中獲取菌種，用________以__________法接種至第二步所制得的__________培養(yǎng)基中，在________℃恒溫箱中培養(yǎng)________h后觀察菌落。
(5)菌種保存：
在無菌操作下將________用________取出，再用________法接種在________上，________培養(yǎng)________后，________冰箱保存。
3．分離實(shí)驗(yàn)的結(jié)果及相應(yīng)結(jié)論：
觀察中若看到在________的末端出現(xiàn)________，則表明菌已被分離了。
4．大腸桿菌分離的用途：________的通用方法，也是用于________的最簡便方法之一。
答案：1.(1)擴(kuò)增　液體　(2)分離　固體平面　劃線
2．(1)高壓鍋　1 kg　15　(2)三角瓶　培養(yǎng)皿　60 ℃
固體　超凈臺　培養(yǎng)皿　固體平面　(3)斜面　三角瓶　液體
接種環(huán)　液體　37 ℃　12 h　(4)固體平面　劃線　接種環(huán)
劃線　固體平面　37　12～24　(5)單菌落　接種環(huán)　劃線　斜面　37 ℃　24 h　4 ℃
3．劃線　不連續(xù)的單個(gè)菌落
4．消除污染雜菌　篩選高表達(dá)量菌株

核心解讀HEXINJIEDU

1．微生物、細(xì)菌與大腸桿菌之間有怎樣的關(guān)系？
(1)概念內(nèi)涵：其關(guān)系圖解見下

(2)結(jié)構(gòu)上：三者都是結(jié)構(gòu)簡單，形體微小的生物，但是從細(xì)胞角度看其結(jié)構(gòu)是不同的，具體如下：

2．培養(yǎng)大腸桿菌的LB培養(yǎng)基中有各種物質(zhì)，為什么選擇這些物質(zhì)，這些物質(zhì)有什么作用呢？
(1)人們按照微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的不同需求，配制出了供其生長繁殖的營養(yǎng)基質(zhì)——培養(yǎng)基。雖然各種培養(yǎng)基的具體配方不同，但一般都含有五大營養(yǎng)要素，即水、無機(jī)鹽、碳(提供碳元素)、氮(提供氮元素)和生長因子(不同的細(xì)菌需要的各不相同，有物種差異，它主要補(bǔ)充自身不能合成的或合成能力較弱的，但卻是生長繁殖必需的物質(zhì))。見下表：

微生物的營養(yǎng)要素定義功能類型化合物類型常用物質(zhì)
碳凡可構(gòu)成微生物細(xì)胞和代謝產(chǎn)物中碳架的營養(yǎng)物質(zhì)稱為碳構(gòu)成細(xì)胞物質(zhì)，供給微生物生長發(fā)育所需要的能量無機(jī)碳(自養(yǎng)型微生物用)無機(jī)物CO2、NaHCO3、CaCO3等
有機(jī)碳(異養(yǎng)型微生物用)蛋白質(zhì)、核酸類牛肉膏、蛋白胨、花生粉餅、明膠、氨基酸等
糖類脂質(zhì)等葡萄糖、蔗糖、淀粉等
氮凡是構(gòu)成微生物的細(xì)胞物質(zhì)或代謝產(chǎn)物中氮素的營養(yǎng)物質(zhì)稱為氮主要是提供合成原生質(zhì)和細(xì)胞其他結(jié)構(gòu)的原料，一般不作能無機(jī)氮銨鹽NH3、(NH4)2SO4
硝酸鹽NO3
N2空氣
有機(jī)氮牛肉膏、蛋白胨、醇母膏、尿素、明膠等
生長因子一類對微生物正常代謝必不可少且又不能從簡單的碳、氮自行合成的所需極微量的有機(jī)物一般是酶和核酸的組成成分酵母膏、玉米漿、黃豆餅粉、動(dòng)植物組織液、麥芽汁等，復(fù)合維生素
水作用：組成成分；反應(yīng)介質(zhì)；物質(zhì)運(yùn)輸媒體；熱的良導(dǎo)體
無機(jī)鹽作用：維持滲透壓、pH等

(2)大腸桿菌的LB培養(yǎng)基

微生物的營養(yǎng)要素本實(shí)驗(yàn)中大腸桿菌LB培養(yǎng)基配方培養(yǎng)基配方與微生物營養(yǎng)要素的對應(yīng)關(guān)系
LB液體培養(yǎng)基LB固體培養(yǎng)基
氮、
碳、
無機(jī)鹽、
生長因子、
水
瓊脂1 g

蛋白胨0.5 g主要提供大腸桿菌的氮、碳需求
酵母提取物0.25 g主要提供生長因子
NaCl　0.5 g提供無機(jī)鹽
水　50 mL提供水
(3)此外配方中還要注意pH等。
3．該實(shí)驗(yàn)中這些操作的原因
(1)三角錐形瓶中的LB固體培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到60 ℃左右時(shí)，才用轉(zhuǎn)移和分裝，制成固體平面培養(yǎng)基，為什么？你用什么簡易方法快速估計(jì)該溫度？
因?yàn)槿�角錐形瓶中的LB固體培養(yǎng)基中有瓊脂，它在98 ℃以上熔化，在44 ℃以下凝固，當(dāng)冷卻到60 ℃左右時(shí)，不會因溫度過高燙手而不易操作；也不會因?yàn)闇囟冗^低而使三角錐形瓶中的培養(yǎng)基凝固，最終無法轉(zhuǎn)移分裝制成新的平面培養(yǎng)基。
簡易估計(jì)溫度的方法：可以用手觸摸滅菌后的三角錐形瓶，感覺錐形瓶由燙手轉(zhuǎn)為剛剛不燙手時(shí)，則說明已經(jīng)冷卻到60 ℃左右了。
(2)進(jìn)行恒溫培養(yǎng)時(shí)，為什么要將培養(yǎng)皿倒置？
恒溫培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)基中的水分會以水蒸氣的形式蒸發(fā)，倒放培養(yǎng)皿則會使水蒸氣凝結(jié)成水滴留在蓋子上；如果正放培養(yǎng)皿，則水分形成的水滴會落入培養(yǎng)基表面并且擴(kuò)散開。如果培養(yǎng)皿中已形成菌落，則菌落中的菌會隨水?dāng)U散，菌落間相互影響，很難再分成單菌落，達(dá)不到分離的目的，培養(yǎng)皿中的菌落還有可能被蓋子上掉落的水給污染。
(3)將大腸桿菌用接種環(huán)自斜面轉(zhuǎn)移到液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，為什么接種環(huán)必須先深入到斜面冷卻后，才能再取斜面上的菌體？
接種環(huán)在取菌體前曾在酒精燈火焰上灼燒滅菌，一直灼燒至紅，溫度很高，若不冷卻就直接用其取斜面上的菌體，菌體可能因?yàn)榻佑|高溫接種環(huán)而死亡，導(dǎo)致大腸桿菌的轉(zhuǎn)移培養(yǎng)失敗。
(4)用劃線法分離大腸桿菌中，第一次和隨后的幾次劃線前都要灼燒接種環(huán)，它們的原因一樣嗎？在劃線結(jié)束后仍然要灼燒接種環(huán)這又是為什么呢？
雖然每次灼燒都是為了滅菌，但所滅的菌種和原因卻不一樣。

灼燒接種環(huán)的時(shí)間消滅的菌體原因
第一次劃線前其他雜菌防止其他雜菌的侵入而造成污染
隨后的幾次劃線前上次劃線結(jié)束后殘留在接種環(huán)上的實(shí)驗(yàn)菌(本實(shí)驗(yàn)為：大腸桿菌)為了使下一次劃線時(shí)，接種環(huán)上的菌自上次劃線的末端，從而通過劃線次數(shù)的增加，使每次劃線時(shí)菌種的數(shù)目逐漸減少，最終獲得單個(gè)菌落，實(shí)現(xiàn)菌的分離
最后一次劃線結(jié)束后為了防止實(shí)驗(yàn)菌殘留于接種環(huán)而污染環(huán)境和感染實(shí)驗(yàn)人員

(5)用劃線法分離大腸桿菌時(shí)，每次的劃線是怎么樣的？對隨后的劃線的起點(diǎn)有什么要求？為什么這樣要求呢？

每一次的劃線依次的2次劃線之間的關(guān)系各次劃線的分布
圖形輔助理解

劃線的要求不能出現(xiàn)線條的重疊第二次以及隨后的劃線操作，總是從上一次劃線的末端開始不要將最后一區(qū)的劃線與第一區(qū)相連
這樣要求的原因使線條末端細(xì)菌的數(shù)目比線條起始處要少因?yàn)閯澗�后，線條末端細(xì)菌的數(shù)目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開始，能使細(xì)菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐漸減少，最終得到有單個(gè)細(xì)菌繁殖而的單菌落若相連，則可能最后一次劃線末端處的細(xì)菌與第一次的疊加，細(xì)菌的數(shù)目不是最少的，不能使細(xì)菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐漸減少，最終將很難獲得單菌落

4．消毒與滅菌一樣嗎？

概念常用方法應(yīng)用的范圍
消毒使用較為溫和的物理或化學(xué)方法僅殺死物體表面或內(nèi)部一部分對人體有害的微生物(不包括芽孢和孢子)煮沸消毒法：在100 ℃煮沸5～6 min一般物品
巴氏消毒法：70～75 ℃煮30 min或在80 ℃煮15 min對于一些不耐高溫的液體，如牛奶
化學(xué)藥劑消毒法如用酒精擦拭雙手、用氯氣消毒水等
滅菌使用強(qiáng)烈的理化因素殺死物體內(nèi)外所有的微生物(包括芽孢和孢子)灼燒滅菌：酒精燈火焰接種工具的滅菌
干熱滅菌：160～170 ℃下滅菌1～2 h玻璃器皿、金屬工具的滅菌
高壓蒸汽滅菌：121 ℃條下，滅菌15～30 min培養(yǎng)基及容器的滅菌
5.本實(shí)驗(yàn)中還需要了解哪些基礎(chǔ)知識才更便于掌握和理解呢？
(1)牛肉膏蛋白胨的知識
牛肉膏和蛋白胨于動(dòng)物原料，含有糖、維生素和有機(jī)氮等營養(yǎng)物質(zhì)。
1 000 mL牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的營養(yǎng)構(gòu)成

培養(yǎng)基組分提供的主要營養(yǎng)
牛肉膏　5 g碳、磷酸鹽和維生素
蛋白胨　10 g氮和維生素
NaCl　5 g無機(jī)鹽
H2O　定容至1 000 mL氫元素、氧元素
　　(2)巴氏消毒法的知識
巴氏消毒法也稱做低溫消毒法。
日常生活中經(jīng)常用到煮沸消毒法。在100 ℃煮沸 5～6 min 可以殺死微生物的營養(yǎng)細(xì)胞和一部分芽孢。對于一些不耐高溫的液體，如牛奶，則使用巴氏消毒法，在70～75 ℃煮30 min或在80 ℃煮15 min，可以殺死牛奶中的微生物，并且使牛奶的營養(yǎng)成分不被破壞。

題例領(lǐng)悟TILILINGWU

【例題1】 下列操作屬于滅菌的是(　　)
A．用酒精擦拭實(shí)驗(yàn)人員的雙手
B．用氯氣處理水
C．將接種環(huán)在酒精燈火焰上灼燒至紅
D．殺死物體表面或內(nèi)部一部分對人體有害的微生物
解析：此題考查對微生物實(shí)驗(yàn)中滅菌的理解。對微生物培養(yǎng)說，滅菌操作十分重要，其目的就是為了獲得純凈的培養(yǎng)物，其關(guān)鍵是防止外一切雜菌的入侵，不僅僅是對人體有害的微生物。滅菌操作一般使用強(qiáng)烈的物化因素(如：灼燒滅菌、高壓蒸汽滅菌等)。而不是使用較為溫和的物化方法。
答案：C

消毒與滅菌是不同的。兩者除了在物化手段上是否強(qiáng)烈外，所消滅的微生物內(nèi)容也是不同的。滅菌是消除一切雜菌，而消毒僅僅殺死對人體有害的微生物。消毒往往無法消滅微生物的芽孢和孢子。
【例題2】 下列關(guān)于平板劃線的操作及敘述，正確的是 …
(　　)
A．灼燒接種環(huán)之后，為避免其他雜菌的干擾，應(yīng)立即伸入菌液取菌種
B．劃線結(jié)束后，為避免實(shí)驗(yàn)菌污染環(huán)境和感染操作者，所以必須再次灼燒接種環(huán)
C．在第一次劃線前灼燒接種環(huán)和每次劃線前灼燒接種環(huán)的目的相同
D．劃線時(shí)最后一區(qū)域一定要與第一區(qū)域相連，達(dá)到首尾相接
解析：此題考查對劃線法分離大腸桿菌的掌握。這是本實(shí)驗(yàn)的一大重點(diǎn)和難點(diǎn)。A的操作是錯(cuò)誤的，灼燒接種環(huán)之后，要冷卻后方能取菌種，以免溫度太高殺死菌種。B的操作完全正確。C的敘述是錯(cuò)誤的，它們的灼燒目的完全不同，第一次劃線前的灼燒是為了殺死其他雜菌，保證實(shí)驗(yàn)菌的純凈，而隨后的灼燒卻是為了殺死殘留于接種環(huán)上的實(shí)驗(yàn)菌，保證實(shí)驗(yàn)菌隨劃線次數(shù)的增加而減少，每次劃線的菌種自上一次劃線的末端。D的操作也是不正確的，不應(yīng)該相連，這樣才能使最后一次劃線不受第一次劃線的干擾。
答案：B

大腸桿菌的分離所采用的就是劃線分離法。這一方法十分重要。我們不僅要知其每一步具體的操作，還要知其所以然，還要關(guān)注注意事項(xiàng)，避免踏入誤區(qū)。

隨堂訓(xùn)練SUITANGXUNLIAN

1細(xì)菌培養(yǎng)過程中分別采用了高壓蒸汽、酒精、火焰灼燒等幾種不同的處理，這些方法依次用于殺滅哪些部位的雜菌(　　)
A．接種針、手、培養(yǎng)基　　B．高壓鍋、手、接種針
C．培養(yǎng)基、手、接種針 D．接種針、手、高壓鍋
答案：C　解析：滅菌是微生物培養(yǎng)過程中的重要環(huán)節(jié)。其中高壓蒸汽是為了殺滅培養(yǎng)基中的雜菌；酒精擦拭雙手，是滅手上的雜菌；而接種針在火焰上灼燒，就是為了滅接種針上的菌。故C選項(xiàng)是正確的。
2下列關(guān)于倒平板的操作姿勢的敘述中，正確的是(　　)
A．右手無名指及小指夾持含有固體培養(yǎng)基的三角瓶封口膜
B．右手大拇指、食指拿著三角瓶
C．左手拿著培養(yǎng)皿，蓋子放于桌子上
D．倒平板時(shí)，為防止溫度過高，暫時(shí)熄滅酒精燈
答案：A　解析：倒平板技術(shù)是微生物技術(shù)中的基本技術(shù)。只有A是正確的。B中手指姿勢錯(cuò)誤。C錯(cuò)在培養(yǎng)皿蓋放在桌上了。D中熄滅酒精燈不對，整個(gè)過程都需在酒精燈火焰旁完成。

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