1、實驗原理
蛋白質(zhì)的物化理性質(zhì)：形狀、大小、電荷性質(zhì)和多少、溶解度、吸附性質(zhì)、親和力等千差萬別，由此提取和分離各種蛋白質(zhì)。
（1）凝膠色譜法（分配色譜法）：
①原理：分子量大的分子通過多孔凝膠顆粒的間隙，路程短，流動快；分子量小的分子穿過多孔凝膠顆粒內(nèi)部，路程長，流動慢。
②凝膠材料：多孔性，多糖類化合物，如葡聚糖、瓊脂糖。
③分離過程：
混合物上柱→洗脫→大分子流動快、小分子流動慢→收集大分子→收集小分子
洗脫：從色譜柱上端不斷注入緩沖液，促使蛋白質(zhì)分子的差速流動。
④作用： 分離蛋白質(zhì)，測定生物大分子分子量，蛋白質(zhì)的脫鹽等。
（2）緩沖溶液
①原理：由弱酸和相應(yīng)的強堿弱酸鹽組成（如H2CO3?NaHCO3， NaH2PO4/Na2HPO4等），調(diào)節(jié)酸和鹽的用量，可配制不同pH的緩沖液。
②緩沖液作用：抵制外界酸、堿對溶液pH的干擾而保持pH穩(wěn)定。
(3）凝膠電泳法：
①原理：不同蛋白質(zhì)的帶電性質(zhì)、電量、形狀和大小不同，在電場中受到的作用力大小、方向、阻力不同，導(dǎo)致不同蛋白質(zhì)在電場中的運動方向和運動速度不同。
②分離方法：瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳等。
③分離過程：在一定pH下，使蛋白質(zhì)基團帶上正電或負(fù)電；加入帶負(fù)電荷多的SDS，形成“蛋白質(zhì)?SDS復(fù)合物”，使蛋白質(zhì)遷移速率僅取決于分子大小。
2、實驗步驟
（1）樣品處理
① 紅細(xì)胞的洗滌
洗滌紅細(xì)胞的目的是去除雜蛋白，采集的血樣要及時采用低速短時間離心分離紅細(xì)胞，然后用膠頭吸管吸出上層透明的黃色血漿，將下層暗紅色的紅細(xì)胞液體倒入燒杯，再加入五倍體積的生理鹽水，緩慢攪拌10min，低速短時間離心，如此重復(fù)洗滌三次，直至上清液中沒有黃色，表明紅細(xì)胞已洗滌干凈。
②血紅蛋白的釋放
在蒸餾水和甲苯作用下，紅細(xì)胞破裂釋放出血紅蛋白。
注：加入蒸餾水后紅細(xì)胞液體積與原血液體積要相同。加入甲苯的目的是溶解細(xì)胞膜，有利于血紅蛋白的釋放和分離。
（2）粗分離
①分離血紅蛋白溶液
將攪拌好的混合溶液離心后，試管中的溶液分為4層。第一層為無色透明的甲苯層，第2層為白色薄層固體，是脂溶性物質(zhì)的沉淀層，第3層是紅色透明液體，這是血紅蛋白的水溶液，第4層是其他雜質(zhì)的暗紅色沉淀物。將試管中的液體用濾紙過濾，除去之溶性沉淀層，于分液漏斗中靜置片刻后，分出下層的紅色透明液體。
②透析
取1mL的血紅蛋白溶液裝入透析袋中，將透析袋放入盛有300mL的物質(zhì)的量的濃度為20mmol/L的磷酸緩沖液中，透析12h。透析可以去除樣品中分子量較小的雜質(zhì)，或用于更換樣品的緩沖液。
（3）純化：調(diào)節(jié)緩沖液面→加入蛋白質(zhì)樣品→調(diào)節(jié)緩沖液面→洗脫→收集分裝蛋白質(zhì)
（4）純度鑒定??SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳
知識點撥：
注意事項
（1）電泳技術(shù)
電泳技術(shù)就是在電場的作用下，利用待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)以及分子本身大小、形狀等性質(zhì)的差異，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而達到對樣品進行分離、鑒定或提純的目的。
（2）紅細(xì)胞的洗滌
如果分層不明顯，可能是洗滌次數(shù)少、未能除去血漿蛋白的原因。此外，離心速度過高和時間過長，會使白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞一同沉淀，也得不到純凈的紅細(xì)胞，影響后續(xù)血紅蛋白的提取純度。
（3）如何檢測凝膠色譜柱的裝填是否成功
由于凝膠是一種半透明的介質(zhì)，因此可以在凝膠柱旁放一支與凝膠柱垂直的日光燈，檢查凝膠是否裝填得均勻。
此外，還可以加入大分子的有色物質(zhì)，觀察色帶移動的情況。如果色帶均勻、狹窄、平整，說明凝膠色譜柱的性能良好。如果色譜柱出現(xiàn)紋路或是氣泡，輕輕敲打柱體以消除氣泡，消除不了時要重新裝柱。
（4）為什么凝膠的裝填要緊密、均勻？
如果凝膠裝填得不夠緊密、均勻，就會在色譜柱內(nèi)形成無效的空隙，使本該進入凝膠內(nèi)部的樣品分子從這些空隙中通過，攪亂洗脫液的流動次序，影響分離的效果。
（5）沸水浴處理加入洗脫液的濕凝膠的目的
不但節(jié)約時間，還能除去凝膠中可能帶有的微生物和排除凝膠內(nèi)的空氣。
（6）G-75
“G”代表凝膠的交聯(lián)程度，膨脹程度及分離范圍，75表示凝膠得水值，即每克凝膠膨脹時吸水7.5g。
（7）裝填完后，立即用洗脫液洗脫的目的：使凝膠裝填緊密
（8）加入檸檬酸鈉有何目的？為什么要低速、短時離心？為什么要緩慢攪拌？
防止血液凝固；防止白細(xì)胞沉淀；防止紅細(xì)胞破裂釋放出血紅蛋白。
（9）與其他真核細(xì)胞相比，紅細(xì)胞的特點及這一特點對進行蛋白質(zhì)的分離的意義
哺乳動物及人的成熟的紅細(xì)胞是雙面凹圓餅狀，沒有細(xì)胞核和細(xì)胞器。其含有的血紅蛋白是有色蛋白，因此在凝膠色譜分離時可以通過觀察顏色來判斷什么時候應(yīng)該收集脫液。這使血紅蛋白的分離過程非常直觀，大大簡化了實驗操作。
（10）如何檢測血紅蛋白的分離是否成功
如果凝膠色譜柱裝填得很成功、分離操作也正確的話，能清楚地看到血紅蛋白的紅色區(qū)帶均勻、狹窄、平整，隨著洗脫液緩慢流出；如果紅色區(qū)帶歪曲、散亂、變寬，說明分離的效果不好，這與凝膠色譜柱的裝填有關(guān)。
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